信使核糖核酸疫苗的制备和传递技术
mRNA疫苗已成为预防传染病和治疗癌症的通用技术。在疫苗接种过程中，mRNA的形成和传递策略有助于抗原的有效表达和提呈，并促进免疫刺激。信使rna疫苗以各种不同的形式被递送:被递送载体包裹，如脂质纳米颗粒、聚合物、多肽、溶液中的游离信使rna，以及体外通过树突状细胞。适当的给药材料和处方方法往往能提高疫苗的效力，选择适当的给药途径也会影响疫苗的效力。在某些情况下，多信使rna共传递可产生协同效应，进一步增强免疫力。在本章中，我们概述了mRNA疫苗的制备和传递技术的最新进展和存在的挑战，并对未来的发展进行了展望。
介绍
自1990年首次使用体外转录信使RNA (mRNA)在小鼠中表达外源性蛋白以来(Wolff et al. 1990)， mRNA已发展成为一个跨越许多治疗和预防领域的多功能平台(Hajj和Whitehead 2017;Xiong et al. 2018;Li et al. 2019;Patel et al. 2019b;Pardi et al. 2020;翁等人，2020)。特别是，许多mRNA疫苗正在开发，以应对传染病和各种类型的癌症，其中许多已进入不同的临床试验阶段(Pardi et al. 2018)。
体外转录mRNA的几个特征有助于其疫苗潜力。首先，mRNA疫苗的开发过程可能比传统蛋白质疫苗快得多(DeFrancesco 2017)。为了应对2020年的严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)大流行，在病毒基因组序列被揭示后的10周内，一种mRNA疫苗被用于1期临床试验的首位志愿者(Lurie et al. 2020)。其次，体外转录反应易于进行，产量高，可放大(Pardi et al. 2018)。先进的工业装置可以制造公斤级的mRNA (Versteeg et al. 2019)。第三，mRNA疫苗能够原位合成抗原蛋白，消除了对某些抗原具有挑战性的蛋白质纯化和长期稳定的需要。第四，mRNA的运输和储存可能比基于蛋白质的疫苗更容易，因为RNA，如果对核糖核酸酶(RNases)进行适当保护，与蛋白质相比，更不容易降解(Stitz et al. 2017;Zhang et al. 2019)。由于这些优点，mRNA疫苗在及时生产和部署以应对快速传染病暴发方面具有巨大的潜力。
尽管MRNA的吸引人的特征和领域的进步，但体内递送mRNA仍然具有挑战性。第一个挑战是mRNA的不稳定性主要是由于RNASES的酶促降解。在整个身体中普遍存在的情况下普遍存在，以降解外源RNA（Gupta等，2012）。和mRNA组成的数百至数千个核苷酸，必须在全长上到达胞嘧醇以进行主动翻译。因此，对RNASES的保护对于大多数体内交付策略至关重要。其次，由于负荷和大尺寸的mRNA分子，高效的mRNA细胞内递送是另一个挑战。负电荷可防止大多数mRNA穿过带负电荷的细胞膜的转移。大尺寸使得高效封装和交付比其他有效载荷更具有挑战性，例如小分子，siRNA和反义寡核苷酸（ASOS）。已经调查了各种交付策略，以解决这些障碍，以不同的交付材料，制定方法和主管部门提供。
用作疫苗的MRNA可以分为常规MRNA和自我放大MRNA。常规MRNA类似于哺乳动物细胞中的内源MRNA，由5'帽，5'UTR，编码区，3'UTR和多腺苷酸化尾巴（Pardi等，2018; Kowalski等，2019）。典型的尺寸为1-5 k核苷酸。当递送到细胞溶溶胶时，这种类型的mRNA被翻译直至其降解而无需额外复制。另一方面，自我放大MRNA来自单链RNA病毒的基因组，例如alphaVirouses（Brito等，2015）。除了编码感兴趣的蛋白质之外，自我扩增MRNA编码复制机制，包括几种病毒非结构蛋白（NSP）以复制自己。因此，它们的典型尺寸约为8-12k核苷酸，大于常规mRNA疫苗。当递送到细胞溶溶胶时，自我放大MRNA在表达相对较大量的指定蛋白（Iavarone等人2017）时复制自己。更重要的是，由于其自助性性质（Maruggi等，2019），自我放大MRNA对于疫苗应用是独特的疫苗应用。许多涉及它们的自我复制过程的因素，例如复制的双链RNA（DSRNA）中间体（Von Herrath和Bot 2003）和复制机械中的NSP（Maruggi等，2013），可以刺激干扰素介导的 immune responses (Pepini et al. 2017).
三种主要类型的蛋白质由mRNA疫苗编码:抗原(Grunwitz and Kranz 2017;Zhang et al. 2019)，中和抗体(Stadler et al. 2017;Tiwari等人2018年)和具有免疫刺激活性的蛋白质(Bonehill等人2008年;Manara et al. 2019)。抗原或中和抗体诱导特异性免疫反应，而具有免疫刺激活性的蛋白质，如CD70 (Van Lint等，2012)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) (Manara等，2019)可促进先天和/或适应性免疫。
近年来的研究进展使mRNA成为一个有前途的疫苗平台。例如，使用核苷酸类似物(如假尿嘧啶)对RNA进行化学修饰，通过减少未修饰核苷酸引发的翻译抑制，大大增加了体内的蛋白质产量(Kariko et al. 2008;Warren et al. 2010)。高效液相色谱(HPLC)纯化进一步提高了mRNA的纯度和翻译能力，通过去除体外转录的副产物，如dsRNA，这些副产物可能会抑制mRNA翻译(Karikó et al. 2011;Weissman et al. 2013)。脂质和脂质衍生纳米颗粒(LNPs)以前被用于递送小分子药物和sirna (Brito et al. 2015;Ickenstein and Garidel 2019)。LNPs对mRNA递送的适应性大大提高了mRNA在体内和体外的递送效率(Dimitriadis 1978;Malone等人，1989;Martinon等人，1993年)。 The use of new formulation technologies, such as continuous-flow microfluidic devices, enabled reproducible production of nanoparticles at various scales with controllable sizes (Jahn et al. 2008; Valencia et al. 2012).
在本章中，我们总结了mRNA疫苗的局部途径，讨论mRNA递送载体及其相应的制剂方法，并概述mRNA疫苗的挑战和未来发展。近期MRNA疫苗交付的全面概述可能有助于未来的新型交付策略和有效的mRNA疫苗的发展。
在这里阅读完整的章节:曾春，张春，Walker p.g.，董勇(2020)信使核糖核酸疫苗的制备和传递技术。在： 。微生物学和免疫学的当前主题。Springer，柏林，海德堡。https://doi.org/10.1007/82_2020_217
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